大多數(shù)腫瘤分析檢測(cè)工作流程使用福爾馬林固定和石蠟包埋 (FFPE) 的組織活檢樣本，該過程會(huì)給組織標(biāo)本中的核酸帶來化學(xué)損傷。從 FFPE 組織中提取的 DNA 中可能會(huì)發(fā)現(xiàn)脫嘌呤、脫嘧啶、脫氨、氧化、缺口和雙鏈斷裂，從而導(dǎo)致核酸碎片化。胞嘧啶脫氨會(huì)導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果不正確，并可能影響 FFPE DNA 樣本中較低頻率變異的準(zhǔn)確識(shí)別，但所有類型的損傷都會(huì)影響測(cè)序質(zhì)量（例如覆蓋均勻性）和下游基因組分析。1

為了評(píng)估核酸損傷和提取方法對(duì)NGS的影響為了評(píng)估結(jié)果并驗(yàn)證分析工作流程對(duì) FFPE 樣本的適用性，應(yīng)包括全流程 FFPE 參考材料。但是，它應(yīng)該代表真實(shí)樣本才有用。1 LGC Clinical Diagnostics開發(fā)了一系列此類參考材料，用于分析 DNA 變體、RNA 融合和復(fù)雜的基因組特征（TMB、MSI 和 HRD），包括模擬存檔組織活檢標(biāo)本損傷和尺寸分布的受損 FFPE DNA 產(chǎn)品。

從 FFPE 樣本中獲得的 DNA 產(chǎn)量、完整性、測(cè)序指標(biāo)和測(cè)量的變異等位基因頻率 (VAF) 可能因使用的提取試劑盒而有很大差異。2這種差異可能是由于不同片段長度的 DNA 的相對(duì)提取效率不同，以及在使用相應(yīng)試劑盒進(jìn)行 DNA 分離過程中逆轉(zhuǎn)甲醛損傷的偏差。

雖然 Seraseq ® FFPE 參考材料保證每卷 DNA 產(chǎn)量 >100 ng 或 RNA >400 ng，但這僅適用于使用與 LGC Clinical Diagnostics 用于產(chǎn)品發(fā)布測(cè)試的相同提取試劑盒的情況，因?yàn)楫a(chǎn)量可能會(huì)有所不同（見表 1）。雖然較低的產(chǎn)量不會(huì)影響下游結(jié)果，但最大限度地提高核酸提取的性能可確保將足夠的樣本輸入到不同的測(cè)序方案中。以下是一些有助于防止產(chǎn)量低和樣本損失的建議，重點(diǎn)是 DNA 提取。

表 1.不同 Seraseq ® FFPE 參考材料獲得的 DNA 和 RNA 產(chǎn)量的差異。對(duì)于所有值，± 表示一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差；除非另有說明，否則數(shù)據(jù)代表單個(gè)批次的材料。#所有發(fā)布批次的平均內(nèi)部數(shù)據(jù) * 來自外部實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)。

從生物合成 FFPE 樣本中提取 DNA 的成功步驟  

Seraseq ®樣本顆粒比臨床樣本的顆粒更小、更透明，可能難以看到。采取以下預(yù)防措施可能會(huì)有所幫助：

• 將 Seraseq ®樣本與臨床樣本一起提取，以便直觀地追蹤樣本。

• 在管子和蓋子的外側(cè)做上標(biāo)記，然后將其放入離心機(jī)中，使標(biāo)記朝向轉(zhuǎn)子的外側(cè)（預(yù)計(jì)有沉淀物的位置）。

• 當(dāng)使用需要丟棄上清液的協(xié)議時(shí)，如果對(duì)沉淀的位置有任何疑問，請(qǐng)?jiān)谇皫状芜\(yùn)行中保存上清液。

使用自動(dòng)化方案提取的 DNA 產(chǎn)量往往低于相應(yīng)的手動(dòng)方案。使用自動(dòng)化提取系統(tǒng)時(shí)，我們始終建議使用參考材料（例如 Seraseq ® WT FFPE 材料）驗(yàn)證新的自動(dòng)化儀器。

QIAamp®DNA FFPE 組織試劑盒 (Qiagen)

• 可以將 1 mL 二甲苯直接加入裝有卷曲的產(chǎn)品管小瓶中（圖 3A），以避免卷曲轉(zhuǎn)移。撕掉產(chǎn)品管標(biāo)簽可能會(huì)有所幫助，以便更好地查看管內(nèi)的內(nèi)容。如果需要將卷曲轉(zhuǎn)移到新小瓶中，我們建議嘗試將產(chǎn)品小瓶放在另一個(gè)小瓶頂部，輕拍它，避免使用鑷子?；蛘撸梢韵仍谠脊苤腥芙饩砬?，然后將所有內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到新管中。

• 脫蠟后去除二甲苯時(shí)，要謹(jǐn)慎。只取出 900 uL，其余留在小瓶中，以免擾亂沉淀物。在加入乙醇之前，在化學(xué)罩內(nèi)風(fēng)干。

• 只有在加入乙醇沉淀后，DNA 才會(huì)顯現(xiàn)出來。如果不容易看見，可在渦旋后倒置小瓶幾次以觀察它。沉淀物應(yīng)呈白色膠狀物質(zhì)（圖 3B）。離心后，沉淀物應(yīng)在管底呈顆粒狀清晰可見（圖 3C）。

• 離心沉淀后，盡可能多地除去上清液，但要小心避免擾動(dòng)和/或吸出沉淀物。使用較小尺寸的移液器可能會(huì)有所幫助。

Maxwell® RSC DNA FFPE 試劑盒（Promega） 

• 熔化和脫蠟孵育溫度至關(guān)重要；溫度過高會(huì)導(dǎo)致 DNA 產(chǎn)量降低，因?yàn)闃颖局袉捂?DNA 過多。將小瓶密封也很重要。

• 沒有沉淀，因此丟失樣品的風(fēng)險(xiǎn)較低。然而，在 RNAse 之后去除水層時(shí)必須小心一種處理方法，避免轉(zhuǎn)移任何變性的蛋白質(zhì)界面，因?yàn)樗鼤?huì)堵塞墨盒并降低產(chǎn)量。

AllPrep® DNA /RNA FFPE 試劑盒 (Qiagen)

• 遵循與 QIAamp ® DNA FFPE 組織試劑盒類似的總體預(yù)防措施

• 在用蛋白酶 K 處理之前將沉淀物重新懸浮在緩沖液 PKD 中時(shí)，可以通過用力添加緩沖液將其去除來實(shí)現(xiàn)可視化。

• 如果不是同時(shí)提取 RNA，則在去除上清液時(shí)要謹(jǐn)慎，以免丟失 DNA。

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